电泳 各物质作用简述

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏
直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关; 
制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,具体作用后面介绍; 
TEMED与AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固; 
十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。  tris中文品名: 三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 缓血酸胺 
你要知道Tris是个很会吃酸的东西,1M的Tris能吃下很多很多的HCl,换句话说,你如果用0.1M的盐酸调500ml Tris的pH,可能倒下整整一瓶的盐酸都不够,硬生生把原本500ml加到了800ml也说不定。 
电泳原理 
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应,它具有两种形式,一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质在电泳中保持完整的状态,蛋白在其中依三种因素分开:蛋白大小,形状和电荷。  
  而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术**先是1967年由shapiro建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。  
  SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。  
  SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,于连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。  
  浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩**一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子**快,甘氨酸根离子**慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率**大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。  
  此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。   
电泳中常见现象 
哈哈,新葡萄娱乐在线网站做过这个论文哈! 
1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响? 
      在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 
      所以,pH对整个反应体系的影响是**关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应**要考虑该因素。 2. 样品如何处理? 
      根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 
      1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。 
      2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。 
      3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。 
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用? 
      聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关; 
      制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径? 
      聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 
      一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 5.“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因? 
      主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。       处理办法:待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因? 
      主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 
      处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象? 
      主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 
      处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
8. 为什么带出现纹理现象? 
      主要是样品不溶性颗粒引起的。 
      处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”,如何处理? 
      “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的**学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 
      处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用? 
       新葡萄娱乐在线网站在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 
      处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗? 
      电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。 
      处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压; 
12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢? 
      这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的**缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。       处理办法:电泳槽正确装配即可。 
13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗? 
      这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。 
14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长? 
      可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。

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